Пиво и напитки Спиртовая промышленность

Ферменты бродильных производств

Ферментами, или энзимами, называют биологические катализаторы белковой природы, вырабатываемые живыми клетками, но в своем действии от них не зависимые. Слово «фермент» — производное от латинского fermentum — «закваска»; слово «энзим» происходит от древнегреческого «эн зюме», что значит «в дрожжах». Значение ферментов для живых организмов огромно. Они принимают участие в процессах обмена веществ между организмом и внешней средой. Большое значение ферменты имеют в бродильной промышленности, так как важнейшие процессы бродильных производств происходят под действием ферментов.

В настоящее время известно более 875 ферментов, получено в кристаллическом виде или в состоянии высокой степени очистки более 140 ферментов. Все ферменты разделяют на однокомпонентные и двухкомпонентные. Однокомпонентные ферменты являются простыми белками. Двухкомпонентные ферменты состоят из белковой части и небелковой части, называемой простетической, или активной, группой. Белковую часть молекулы фермента называют ферон, а, простетическую — агон, или кофермент. Примером одиокомпонентного фермента может служить амилаза, двухкомпонентного — пируватдекарбоксилаза (Фермент, катализирующий расщепление пировиноградной кислоты на уксусный альдегид и углекислый газ). Большинство ферментов однокомпонентны.

В однокомпонентных ферментах роль активных групп выполняют определенные химические группировки, входящие в состав белка. Эти группировки называются активными центрами ферментов. Активный центр — это часть молекулы ферментного белка, с помощью которой фермент соединяется с субстратом и от которой зависят каталитические свойства фермента. При нарушении активного центра фермент теряет каталитическую активность, в то время как другие части молекулы фермента могут  быть разрушены или удалены без ее потери.

В состав активной группы двухкомпонентных ферментов, катализирующих реакции окисления, входят витамины В2; в ферменты, участвующие в превращениях  аминокислот, — витамин В6; в составе активной группы некоторых окислительных ферментов находятся группировки, содержащие атом кислорода.

Классификация ферментов

По характеру действия ферменты разделяют на следующие основные классы:

  1. Оксидоредуктазы (окислительно-восстановительные ферменты). К этому классу ферментов относятся те, которые катализируют перенос атома водорода и электронов. Ферменты, относящиеся к этому классу, катализируют окислительно-восстановительные реакции, происходящие при дыхании и брожении.
  2. Трансферазы (ферменты переноса). Эти ферменты катализируют перенос целых атомных группировок, например остатков фосфорной кислоты, остатков моносахаридов и аминокислот, аминных или метальных групп, от одного соединения к другому.
  3. Гидролазы. К классу гидролаз относятся ферменты, катализирующие расщепление различных сложных органических соединений на более простые с присоединением воды.
  4. Лиазы. К этому классу относятся ферменты, катализирующие реакции негидролитического отщепления каких-либо групп от субстратов.
  5. Изомеразы — ферменты, которые катализируют превращение органических соединений в их изомеры.
  6. Лигазы (синтетазы). К этому классу относятся ферменты, катализирующие соединение двух молекул, сопровождающееся расщеплением связи в сложных органических веществах — нуклеозидтрифосфатах, которые имеют большое значение для обмена веществ живой клетки.

Эти классы подразделяются на подклассы, которые в свою очередь делятся на более мелкие группы.

Свойства ферментов

Обратимость действия ферментов

Ферменты могут ускорять как прямую, так и обратную реакцию. Это значит, что они, осуществляя реакции расщепления определенных веществ, при определенных условиях Могут оказывать и синтетическое действие. Некоторые реакции ферментативного синтеза доказывают обратимость действия ферментов, однако новейшие исследования показали, что в большинстве случаев ферментативный синтез сложных и даже сравнительно простых соединений в живой клетке осуществляется не теми ферментами, которые катализируют их расщепление, и, следовательно, не является следствием обратимости действия ферментов. Так, например, если гидролиз α-гликозидов и сахарозы катализируют фермент мальтаза (α-глюкозидаза) или фермент сахараза (β-фруктофуранозидаза), то синтез этих соединений происходит под действием глюкозилтрансфераз. Но это не значит, однако, что в ряде случаев синтез тех или иных соединений в клетке не может быть результатом обратимости действия ферментов.

Специфичность действия ферментов

Для ферментов характерна специфичность действия: каждый фермент действует лишь на вполне определенное вещество или же на определенный тип химической связи в молекуле. Так, например, фермент сахараза разлагает сахарозу и не действует на другие дисахариды (мальтозу, лактозу).

Каталитическая активность ферментов

Каталитическая активность ферментов значительно превосходит активность неорганических катализаторов. Перекись водорода разлагается под каталитическим действием ионов железа на .воду и кислород; эта же реакция катализируется ферментом каталазой, причем если 1 моль ионов железа при 0°С в течение 1 сек разлагает 10-5 молей Н2О2, то моль железа в составе каталазы при тех же условиях разложит 105 молей перекиси водорода.

Таким образом, 1 моль железа в составе каталазы в миллиард раз более активен как катализатор расщепления перекиси водорода, чем 1 моль неорганического железа.

Влияние температуры

Скорость всех химических реакций увеличивается с повышением температуры; возрастает и скорость химических реакций, катализируемых ферментами, активность их увеличивается. Температура, при которой наблюдается наиболее интенсивное действие фермента, называется оптимальной. Оптимальная температура действия большинства растительных ферментов 40—60° С.

При более высоких температурах активность ферментов значительно понижается и многие из них при 70—80° С необратимо разрушаются; это явление называется тепловой инактивацией. Тепловая инактивация ферментов происходит вследствие денатурации белка при высокой температуре. Только очень немногие ферменты способны в определенных условиях выдерживать нагревание до 100° С с сохранением активности. Оптимальная температура действия фермента не является строго постоянной величиной, она, зависит от других условий, в частности от продолжительности воздействия температуры.

Следует отметить, что ферменты чрезвычайно чувствительны к нагреванию в присутствии значительного количества воды. Наоборот, при низкой влажности и в сухом состоянии ферменты менее чувствительны к нагреванию и без значительной инактивации выдерживают температуру около 100° С. Это свойство ферментов учитывают при проведении технологических процессов в бродильной промышленности.

Осахаривание крахмала амилолитическими ферментами в спиртовом и пивоваренном производствах проводят при температуре 61—63° С; этот процесс происходит в растворе (высокая влажность), поэтому повышение температуры выше указанной повлечет за собой инактивацию ферментов. Сушку солода (проросшего зерна), когда достигнута низкая влажность (2—3%) проводят при высокой температуре, так как опасность инактивации ферментов в таких условиях невелика.

Влияние концентрации водородных ионов

Концентрация водородных ионов (pH) также значительно влияет на активность ферментов. Каждый фермент проявляет свое действие в определенных, довольно  узких, пределах значений pH. Пределы значений pH, при которых каталитическая активность фермента наибольшая, называется оптимальной зоной pH. Различные ферменты значительно отличаются один от другого по оптимальным для их действия величинам pH.

Активаторы и ингибиторы ферментов

Активность большинства ферментов зависит от содержания в реакционной среде различных веществ. Вещества, которые повышают каталитическую активность ферментов, называются активаторами. Часто активаторами ферментов являются ионы металлов: Na+, К+, Mg++, Са++, Zn++, Cu++, Mn++, Fe++. Для активации фермента требуется один или несколько ионов. Активаторами ферментов могут быть и другие вещества. Активность фермента амилазы повышается в присутствии ионов йода, брома и хлоридов; протеолитические ферменты становятся более активными при наличии в среде HCN, H2S и веществ, содержащих сульфгидрильные (SH) группы.

Существуют также вещества, которые подавляют действие ферментов. Такие вещества называются ингибиторами. Их можно разделить на две группы: общие и специфические ингибиторы. К общим ингибиторам относятся соли тяжелых металлов: свинца, серебра, ртути, вольфрама; трихлоруксусная кислота, танин. Ферменты, ускоряющие спиртовое брожение (комплекс ферментов зимаза), содержат сульфгидрильные группы. Поэтому зимазный комплекс инактивируется ингибиторами сульфгцдрильных групп: этилйодацетатом, йодацетамидом, хлорацетофеноном и другими галоидсодержащими соединениями.

Ферменты бродильных производств

В бродильных производствах важное значение имеют гидролазы, оксидоредуктазы, трансферазы, лиазы, изомеразы. Все они, за исключением гидролаз, катализируют реакции, которые происходят при спиртовом и других видах брожения: комплекс ферментов, катализирующих реакции спиртового брожения, называется зимаза (зимазный комплекс).

Гидролазы

Из гидролаз важное значение в бродильных производствах имеют: а-глюкозидаза, β-фруктофуранозидаза, а-галактозидаза, амилазы, гемицеллюлазы, неполитические и протеолитические ферменты.

  • α-Глюкозидаза, или мальтаза, — это фермент, катализирующий расщепление мальтозы с образованием глюкозы; он содержится в плесневых грибах, дрожжах, бактериях.
  • β-Фруктофуранозидаза (сахараза, инвертаза) расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу, действует также на раффинозу, разлагая ее на фруктозу и мелибиозу. β-Фруктофуранозидаза содержится в дрожжах и высших растениях.
  • α-Галактозидаза (мелибиаза) расщепляет мелибиозу с образованием галактозы и глюкозы, разлагает также раффинозу на сахарозу и галактозу. Содержится в пивных дрожжах, ферментном препарате, получаемом из  плесневого гриба Asp. oryzae.

Ферменты, катализирующие гидролиз крахмала, называются амилолитическими ферментами, или амилазами. Амилазы гидролизуют неизмененный (нативный) крахмал, крахмальный клейстер и растворимый крахмал. Действие амилазы на неизмененные или механически поврежденные крахмальные зерна незначительно, значительно быстрее амилазы действуют на крахмальный клейстер и растворимый крахмал. Длительное время считали, что амилаза представляет собой один фермент. В настоящее время известны три типа амилаз: α-амилаза, β-амилаза и глюкоамилаза. α-Амилаза, содержится в плесневых грибах, бактериях, в проросшем зерне пшеницы, ржи, ячменя. р-Амилаза содержится в зерне пшеницы, ржи, ячменя. Глюкоамилаза, (глюканамилаза) содержится в плесневых грибах, «в частности в Asp.  awamori. α- и β-амилазы отливаются устойчивостью к кислотности среды (pH) и к нагреванию. Более чувствительна к повышению кислотности среды а-амилаза. Оптимальная зона pH для α-амилазы около 5,7, для β-амилазы— около 4,8. Доведение величины pH среды до  3,3 при температуре 0°С ведет почти к полной инактивации а-амилазы; в этих же условиях β-амилаза в значительной мере сохраняет свою активность. Более устойчива к действию повышенных температур а-амилаза. Оптимальная температура ее действия выше оптимальной температуры действия β-амилазы. По данным С. И. Пронина, оптимальная температура действия α-амилазы, ячменя 51—60° С, ржи 54—63° С, β-амилазы  ячменя 48° С, ржи 51° С. При нагревании раствора, содержащего α-амилазу, до 70° С в течение 15 мин активность ее снижается незначительно; 6-амилаза в этих условиях инактивируется полностью. Различные α-амилазы отличаются по своей устойчивости к нагреванию или, как говорят, по термолабильности. Наиболее лабильной, т. е.  быстрее всего разрушающейся при нагревании, является α-амилаза плесневых грибов, на -втором месте зерновая α-амилаза (α-амилаза проросшего зерна — солода) и наиболее устойчива к нагреванию бактериальная а-амилаза.

При действии на крахмал β-амилаза отщепляет от глюкозных цепочек молекулы мальтозы, состоящие из двух глюкозных остатков. Действие α-амилазы на крахмал начинается с разрыва связей в любом месте цепочки. Образовавшиеся цепочки меньшей длины расщепляются далее, вплоть до образования молекул мальтозы. α- и β-амилазы разрывают только связь глюкозных колец 1—4, а, связь 1—6 ими не затрагивается. При действии на крахмал β-амилазы образуется преимущественно мальтоза и небольшое количество декстринов; α-амилаза расщепляет крахмал с образованием главным образом декстринов и небольшого количества мальтозы. Глюкоамилаза расщепляет крахмал с образованием преимущественно глюкозы и небольшого количества декстринов; фермент этот весьма устойчив к ионам водорода.

При совместном действии α- и β-амилаз на крахмал примерно 80% его превращаются в мальтозу и около 20%— в декстрины. Если же удалить образующуюся мальтозу (например, сбраживая ее дрожжами), то 92—95% крахмала превращается в мальтозу. Оставшиеся неосахаренными декстрины называют конечными декстринами; эти декстрины расщепляются под действием фермента олиго-1,6-глюкозидазы, или, как его называют, декстриназы.

Гемицеллюлазы, или цитазы, — ферменты, катализирующие гидролиз гемицеллюлоз. Эти ферменты образуются в зерне при его проращивании, а также продуцируются плесневым грибом Trichothecium roseum.
Ферменты, гидролизующие пектиновые вещества, называются пектолитическими. Эти ферменты содержатся в плесневых грибах. К пектолитическим ферментам относится протопектиназа, пектинэстер’аза, полигалактуроназа. Протопектиназа расщепляет протопектин с образованием метоксилированной полигалактуроновой кислоты (так называемый растворимый пектин), арабана и галактана,. Фермент пектинэстераза (пектаза) катализирует расщепление растворимого пектина с образованием метилового спирта и полигалактуроновой кислоты. Полигалактуроназа (пектиназа) расщепляет связь между остатками полигалактуроновой кислоты, которые не содержат метоксильных групп.

Протеолитические ферменты, или протеазы, катализируют гидролиз белков и пептидов. Протеазы содержатся в плесневых грибах, в дрожжах, бактериях и зерновых злаках. Принято делить протеазы на протеиназы и пептидазы. Протеиназы катализируют гидролиз белков с образованием пептидов и аминокислот, пептидазы — гидролиз пептидов. Это деление протеаз на протеиназы и пептидазы условно, так как известны протеиназы, способные гидролизовать пептиды.

Амидазы — это ферменты, катализирующие гидролиз амидов с образованием аммиака, и аминокислот. К этой группе ферментов относятся аспарагиназа и глютаминаза. Аспарагиназа катализирует расщепление аспарагина на аспарагиновую кислоту и аммиак, глютаминаза — расщепление глютамина на глютаминовую кислоту и аммиак. Аспарагиназа и глютаминаза содержатся в плесневых грибах, дрожжах, бактериях и высших растениях.

К гидролазам относится и фермент фитаза, отщепляющий остаток фосфорной кислоты от инозитфосфорной кислоты. Фитаза, содержится в дрожжах и в семенах многих растений.

Трансферазы

К трансферазам относятся ферменты, катализирующие перенос целых атомных группировок от одного соединения к другому. Ферменты, катализирующие перенос остатков моносахаридов, называются гликозилтрансферазы; ранее их называли фосфорилазы. Эти ферменты катализируют реакцию фосфоролиза, т. е. расщепляют сложные органические соединения при действии фосфорной кислоты на более простые с образованием сложных эфиров фосфорной кислоты. Представителем фосфорилаз является крахмальная фосфорилаза, расщепляющая крахмал с образованием фосфорнокислого эфира глюкозы. Фосфорилазы содержатся в высших растениях и дрожжах. Реакция фосфоролиза обратима.

Синтез крахмала в растениях и частичный распад его при хранении картофеля и зерновых злаков происходит под действием фосфорилаз.

Зимаза

В дрожжах содержится комплекс ферментов, объединяемых одним названием — зимаза. Этот комплекс ферментов осуществляет реакцию спиртового брожения гексоз.

Химизм процессов брожения

Наиболее важными видами брожений являются спиртовое, молочнокислое и маслянокислое. Эти виды брожений можно суммарно выразить следующими уравнениями:

Ферменты бродильных производств

Эти уравнения дают только представление о начальных и конечных продуктах брожения, но не объясняют образования ряда промежуточных продуктов при брожении, не вскрывают последовательности и взаимосвязи отдельных реакций, происходящих при брожении.

Спиртовое, молочнокислое и маслянокислое брожение являются основными типами брожений, они тесно связады между собой и находятся в тесной связи с нормальным кислородным (аэробным) дыханием, которое протекает по уравнению:

Спиртовое, молочнокислое и маслянокислое брожение по реакции

Химизм брожения изучали многие ученые: Л. А. Иванов, А. Гарден, С. П. Костычев, К. Нейберг, А. Н. Лебедев, Г. Эмбден, О. Мейергоф и др. Л. А. Иванов и А. Н. Лебедев установили, что в процессе брожения важную роль играет фосфорная кислота. Она всегда находится в дрожжах и других живых организмах в виде аденозинмонофосфорной кислоты (АМФ), аденозиндифосфорной кислоты (аденозиндифосфат — АДФ) и аденозинтрифосфорной кислоты (аденозинтрифосфат — АТФ). Эти кислоты легко отщепляют фосфорную кислоту.

Весь процесс брожения (спиртового, молочнокислого, маслянокислого) можно условно разделить на пять этапов.

Первый этап брожения

Первый этап — образование фосфорилированных сахаров. Молекула глюкозы (или другой гексозы) под действием фермента гексокиназы присоединяет остаток фосфорной кислоты от аденозинтрифосфата. В результате этой реакции образуется аденозиндифосфат и глюкопиранозо-6-фосфат, который под действием фермента глюкозофосфатизомеразы превращается во фруктофуранозо-6-фосфат. Образовавшийся фруктофуранозо-6-фосфат при участии фермента фосфофруктокиназы присоединяет еще один остаток фосфорной кислоты от новой молекулы аденозинтрифосфата; в результате этой реакции образуется еще одна молекула аденозиндифосфата и фруктофуранозо-1,6-дифосфат

Рисунок 1 - Первый этап брожения
Рисунок 1 — Первый этап брожения

Второй этап брожения

На втором этапе фруктофуранозо-1,6-дифосфат под действием фермента альдолазы обратимо распадается на 3-фосфоглицериновый альдегид и фосфодиоксиацетон, которые могут взаимопревращаться под действием фермента триозофосфатизомеразы

Рисунок 2 - Второй этап брожения
Рисунок 2 — Второй этап брожения

Дальнейшему превращению в процессе брожения подвергается 3-фосфоглицериновый альдегид. По мере его использования образовавшийся фосфодиоксиацетон под действием триозофосфатизомеразы образует новые количества 3-фосфоглицеринового альдегида.

Третий этап брожения

На третьем этапе фосфоглицериновый альдегид присоединяет еще один остаток фосфорной кислоты за счет неорганического фосфора с образованием 1,3-дифосфоглицеринового альдегида, который под действием фермента триозофосфатдегидрогеназы прекращается в 1,3-дифосфоглицериновую кислоту.

1,3-дифосфоглицериновая кислота под действием фермента фосфотрансферазы отдает остаток фосфорной кислоты молекуле АДФ, причем образуется АТФ и 3-фосфоглицериновая кислота. Последняя под действием фермента фосфоглицеромутазы превращается в 2-фосфоглицериновую кислоту

Рисунок 3 - Третий этап брожения
Рисунок 3 — Третий этап брожения

Четвертый этап брожения

Четвертый этап — превращение 2-фосфоглицериновой кислоты в пировиноградную кислоту. 2-фосфоглицериновая кислота под действием фермента фосфопируватгидратазы (энолазы) образует фосфоэнолпировиноградную кислоту, которая передает остаток фосфорной кислоты молекуле АДФ, причем образуются АТФ и молекула энолпировиноградной кислоты, которая, разлагаясь, превращается в пировиноградную кислоту

Рисунок 4 - Четвертый этап брожения
Рисунок 4 — Четвертый этап брожения

Пировиноградная кислота является промежуточный продуктом брожения, дальнейшие превращения которого приводят к тому или иному процессу — спиртовому, молочнокислому брожению или аэробному дыханию.

Пятый этап брожения

Следовательно, последний — пятый этап брожения может протекать различно. При спиртовом брожении пировиноградная кислота под действием фермента пируватдекарбоксилазы превращается в уксусный альдегид и углекислый газ

Рисунок 5 - Превращение пировиноградной кислоты в уксусный альдегид и углекислый газ
Рисунок 5 — Превращение пировиноградной кислоты в уксусный альдегид и углекислый газ

Уксусный альдегид присоединяет водород и превращается в этиловый спирт (этанол), который в дальнейшем изложении будем называть спирт. Эту реакцию катализирует фермент алькогольдегидрогеназа.

Таким образом, ход распада сахара при спиртовом брожении можно представить следующим образом: сахар → фосфорные эфиры гексоз → фосфотриозы → фосфоглицериновая кислота → пировиноградная кислота → уксусный альдегид → этиловый спирт.

При молочнокислом брожении пировиноградная кислота превращается в молочную кислоту под действием фермента лактатдегидрогеназы:

При молочнокислом брожении пировиноградная кислота превращается в молочную кислоту под действием фермента лактатдегидрогеназы При маслянокислом брожении образующийся из пировиноградной кислоты уксусный альдегид вступает в реакцию альдольной конденсации и получается ацетальдоль, который в дальнейшем превращается в масляную кислоту. Химизм маслянокислого брожения еще недостаточно изучен.

При аэробном дыхании пировиноградная кислота окисляется до углекислоты и воды.

В обычных условиях спиртового брожения (слабокислая среда) наряду с этиловым спиртом образуется небольшое количество глицерина, янтарной и уксусной кислот. Помимо образовавшихся из сахара вторичных продуктов, в сброженных растворах находятся побочные продукты. Они образуются не из сахара, а из других веществ, находящихся в сбраживаемых растворах, главным образом из аминокислот. К побочным продуктам, образующимся при спиртовом брожении, относится сивушное масло, основными составными частями которого являются высшие спирты: пропиловый, изобутиловый, изоамиловый и др. Возможно, что некоторые вторичные продукты спиртового брожения тоже образуются из аминокислот, например янтарная кислота — из глютаминовой кислоты.